Мы в социальных сетях
     
Главная страница Карта сайта Контактная информация
 
  При непосредственном участии МГУ им. М.В. Ломоносова русский       english
 
Ионы Скулачева
 
Ионы Скулачева
 


Омолаживающая сыворотка Mitovitan





Главная » Результаты »

Эксперименты на выделенных митохондриях

Результаты получены группами М.Ю.Высоких, Е.Н.Моховой

Основным объектом и «местом» действия разрабатываемых Проектом соединений являются митохондрии. Существуют методики выделения митохондрий из тканей и работы с изолированными органеллами. Это позволяет изучать действие SkQ на митохондрии in vitro перед тем, как перейти к более сложным экспериментам на клетках и животных моделях. Опыты на изолированных митохондриях показали несколько существенных свойств SkQ:
а) митохондрии действительно накапливают SkQ1 за счет мембранного потенциала,
б) SkQ1 способен восстанавливаться ферментами дыхательной цепи митохондрий, и, таким образом, SkQ1 является антиоксидантом многократного действия,
в) SkQ1 эффективно защищает мембраны митохондрий (и в первую очередь – кардиолипин) от окисления свободными радикалами. При этом «окно концентраций» между минимально эффективной дозой SkQ1 и дозой SkQ1, дающей прооксидантный эффект, составляет более двух порядков.

Изучение способности SkQ1 накапливаться в митохондриях

Во−первых, была протестирована способность веществ на основе SkQ накапливаться в митохондриях. Для проведения этого теста был разработан специальный электрод, способный измерять содержание SkQ1 в среде. С его помощью продемонстрирована способность SkQ1 накапливаться в митохондриях, а также показана зависимость накопления SkQ1 от функционального состояния митохондрий.

Оказалось, что снижение мембранного потенциала митохондрий (движущей силы, которая способствует созданию градиента концентраций SkQ между матриксом митохондрий и средой) стимулирует выход SkQ1 из митохондрий. Однако не весь SkQ1 выходит, значительная его часть, вероятно, вследствие высокой гидрофобности, остается в мембране митохондрий.

Накопление SkQ1 в митохондриях, измеренное с помощью ТФФ+ – электрода


Можно предположить, что высокая гидрофобность SKQ1 может препятствовать его быстрому накоплению в митохондриях клеток, так как прежде всего происходит его перераспределение по многочисленным клеточным мембранам и только после этого SkQ1 начинает накапливаться в митохондриях благодаря их мембранному потенциалу.

Тестирование способности SkQ1 восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий

Ключевым преимуществом синтезированных антиоксидантов группы SkQ является их способность восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий.


Благодаря этому соединения класса SkQ становятся антиоксидантами многократного действия, в отличие от классических антиоксидантов, активность которых заканчивается сразу после взаимодействия с радикалом.

В ходе экспериментов было показано, что SkQ1 восстанавливается комплексами I и II дыхательной цепи. Эксперименты проводили на выделенных митохондриях, которые восстанавливали окисленный SkQ1, используя при этом субстраты I (глутамат с малатом) и II (сукцинат) дыхательных комплексов. Для исключения влияния эндогенных субстратов использовали ингибиторы комплекса I – ротенон, а также ингибитор комплекса II − малонат. Ингибирование комплекса II малонатом на фоне ротенона стимулировало окисление SkQ1 комплексом III.

Способность митохондрий восстанавливать или окислять SkQ1 в зависимости от активности компонентов дыхательной цепи


Полученные данные позволяют утверждать, что SkQ1, окисляющийся при взаимодействии с радикалами, способен эффективно регенерироваться в дыхательной цепи митохондрий. Иными словами, SkQ1 действительно является антиоксидантом многократного действия.

Тестирование про- и антиоксидантной способности соединений группы SkQ на выделенных митохондриях

Эксперименты на изолированных митохондриях позволили обнаружить, что, начиная с определенной концентрации, эти вещества оказывают сильнейшее прооксидантное действие на митохондрии, превращая их в настоящие фабрики по производству свободных радикалов.
Прооксидантная активность соединений определялась по скорости неферментативного одноэлектронного восстановления О2 до О2 − посредством гидрохиноновых форм соответствующих соединений и по стимуляции образования Н2О2 митохондриями сердца крысы. По первому из этих критериев важным наблюдением оказалось то, что восстановленная (хинольная) форма SkQ1 более устойчива к окислению кислородом воздуха, чем MitoQ.

Способность SkQ1 и MitoQ окисляться под действием кислорода воздуха


Тем самым SkQ1 менее склонен спонтанно взаимодействовать с кислородом и образовывать радикалы, что потенциально указывает на его меньшую токсичность для клетки. Что касается второго критерия, то исследованные соединения не слишком сильно отличались друг от друга.

MitoQ, SkQ1, SkQ3 и C12P3P стимулируют генерацию Н<sub>2</sub>О<sub>2</sub> митохондриями сердца крыс. MitoQ, SkQ1, SkQ3 и C12P3P были добавлены в среду инкубации в концентрации 1 мкМ


Тем не менее, следует отметить, что нарастание прооксидантного действия MitoQ на митохондрии происходило при несколько меньших концентрациях этого вещества по сравнению с SkQ1 и SkQ3.

Полученные результаты про- и антиоксидантной активности исследуемых соединений сведены в один рисунок для наглядности. Видно, что у SkQ1 наибольшее «окно применения», т.е. разброс концентраций в котором проявляются его антиоксидантные свойства


Антиоксидантную активность исследуемых соединений определяли в модели окислительного стресса, вызванного добавлением к суспензии митохондрий, энергезированных сукцинатом, смеси аскорбата и Fe2+. Известно, что при окислении сукцината митохондрии генерируют определенное количество пероксида водорода, который в присутствии железа легко восстанавливается до высокоактивного радикала НО(реакция Фентона). В этих условиях происходит перекисное окисление фосфолипидов митохондрий, которое отслеживали по накоплению малонового диальдегида. Перекисное окисление в митохондриях тормозилось всеми соединениями группы SkQ, а также MitoQ, но в разной степени. Наиболее эффективным оказался SkQ1, меньшей антиоксидантной активностью обладал SkQ3, еще меньшей − MitoQ. При этом MitoQ оказался как минимум в 30 раз менее эффективным, чем SkQ1 (рис. выше).

Интересно, что при окислительном стрессе особенно чувствительным компонентом митохондриальной мембраны оказался кардиолипин.

SkQ1 особенно эффективно защищает кардиолипин от окисления<br> гидроксильным радикалом, образующимся в реакции Фэнтона.<br> На рисунке показано распределение фосфолипидов митохондрий:<br> 1 – децилкардиолипин; <br> 2 – фосфатидилинозитол; <br> 3 – монолизокардиолипин;<br> 4 – фосфотидилглицерол; <br> 5 – кардиолипин; <br> 6 – фосфатидилэтаноламин;<br> 7 – фосфатидная кислота; <br> 8 – фосфатидилхолин


Этот фосфолипид специфичен для митохондрий и играет важную роль, определяя физико−химические свойства мембраны, а также взаимодействуя с рядом митохондриальных белков и влияя на их свойства. SkQ1 эффективно препятствовал окислению кардиолипина в условиях окислительного стресса.

Принимая во внимание открытие дозозависимости SkQ, можно предполагать довольно необычные свойства фармпрепаратов на основе SkQ по сравнению с традиционными лекарствами. У большинства обычных фармпрепаратов (например, ингибиторов тех или иных метаболических путей) эффективность тем выше, чем больше дозы препарата. Подбор оптимальной дозировки, как правило, ограничен токсичностью вещества. В случае с митохондриальными антиоксидантами ситуация должна быть совершенно иной. Из−за сильнейшей способности накапливаться внутри клеток и внутри митохондрий они должны начинать действовать в минимальных наноконцентрациях.

Далее с повышением концентрации антиоксидантный эффект препарата исчезнет, будучи нивелирован его прооксидантным действием.

На основе экспериментов на изолированных митохондриях была предсказана<br> следующая зависимость эффекта препарата от дозировки SkQ:<br> <strong>Зона 1</strong> – «недостаток» – доза SkQ недостаточна для снижения окислительного<br> стресса<br> <strong>Зона 2</strong> – «зона роста» - SkQ эффективно снижает окислительный<br> стресс, чем больше дозировка, тем сильнее эффект<br> <strong>Зона 3</strong> – «оптимум» - SkQ достиг максимальной эффективности,<br> еще немного – и начнет проявлять себя прооксидантное действие<br> <strong>Зона 4</strong> – «снижение эффективности» - SkQ все еще снижает<br> окислительный стресс, но прооксидантное действие нарастает<br> <strong>Зона 5</strong> – «передозировка» - SkQ действует как прооксидант


Причем исчезновение эффекта может наступить задолго до проявления собственно токсического действия препарата. Таким образом, при работе с SkQ на моделях различных заболеваний главной задачей является поиск «окна применения» − диапазона доз, в котором SkQ эффективен против конкретного заболевания.

Этот результат – пример того, как, казалось бы, чисто фундаментальная работа с веществом в бесклеточной системе позволяет обнаружить неожиданные свойства, которые необходимо будет учитывать при проведении доклинических и клинических испытаний.

Одна из главных особенностей Проекта «Ионы Скулачева» − тщательнейшая проработка научной базы с целью резкого снижения риска неудачи на более поздних стадиях разработки лекарственных препаратов.


 


 
 
+7 (495) 939-59-45
Электронная почта info@skq-project.ru
  2008 создание сайта:
© 2008-2014 НИИ Митоинженерии МГУ